Title: T4 / MDBI / Moment 1 / Klinisk Kemi / Grundläggande metodprinciper

Q: Vad behövs i en instrumentell analysmetod för koncentrationsbestämningar?
A: - Specificitet
- Signal
- Kalibreringskurva

Q: Vad menas med specificitet?
A: - Hur känner vi igen analyten?
- Kemi

Q: Vad menas med signal?
A: - Hur får vi dne elektriskt mätbara signalen?
- Signal - mätinstrumentet, detektorn
- Signal i en sladd från detektorn till datorn

Q: Vad menas med Kalibreringskruva?
A: - Hur ser sambandet mellan signal och analytkoncentration ut?
- Kalibrering - matematik i datorn av råsignal till en konc

Q: Vad mer vill vi att en instrumentell analysmetid för koncentrationsbestämningar ska vara?
A: Dessutom vill vi så klart gärna att metoden ska vara robust, snabb, billig, etc

Q: Vilka analysprinciper finns (automation)?
A: - ISE jonselektiv elektrod
- Fotometri
- Elektrokemoluminicens

Q: Vad är automationen?
A: Automationen är det storskaliga labbet, analyser som beställs och analyser som behöver akutsvar, labb är igång dygnet runt

Vad kan fotometri delas in i?

Q: Vad delas elektrokemoluminicens in i?
A: - Sandwich
- Kompetitiv

Q: Vad gör en jonselektiv elektrod (ISE)?
A: Mäter spänningen över ett membran som interagerar med en viss typ av joner

Q: Vilka joner detekteras med ISE?
A: Kemiska grupper eller strukturer i membranet avgör vilka joner som detekteras

Vad är spänningen beroende av vid ISE?

Q: Vad är en vanlig typ av mätinstrument baserat på ISE?
A: en pH-meter

Q: Hur är ISE uppbyggt?
A: - Ett jonselektivt membran, yta, som ka interagera med specifika joner, helst ska den bara interagera med de joner man är intresserad av, andra joner binder sämre
- Mycket känsliga jonmätare
- I membranet finns kemiska grupper (organiska molekyler, ex EDTA, eller kristallida strukturer, som kan interagera/binda upp med joner)

Q: Vad sker med jonerna i ISE och hur mäts de?
A: - Interagerar - bindning, transport eller jonbyteseffekter (en jon knuffar ut en annan jon och en kedjereaktion uppstår
- Gemensamt för dessa är att det bildas spänningar över membranytan som man kan mäta
- Spänningen spelar roll för koncentrationen, ju högre konc ju högre spänning
Mäts med referenselektrof för stabila mätningar

Q: Vad indikerar spänningen vid ISE?
A: Spänningen spelar roll för koncentrationen, ju högre konc ju högre spänning

Q: Med vilket instrument mäts fotometri och turbidmetri?
A: Mäts med samma instrument: Spektrofotometer

Vad sker vid fotometri och turbidimetri generellt?

Q: Vad mäter fotometri?
A: Mäter absorbans, hur mycket ljuset minskar pga att det absorberas av provet

Vad mäter turbidimetri?

Q: Hur fungerar fotometri och turbidimetri, kort?
A: Man har en kuvett med provlösning och en lampa man skiner genom lösningen och man ser hur mycket ljus som kommer igenom

Q: Vad sker här?
A: Diffraktion bryter upp det vita ljuset i olika väglängder (12 olika våglängder mäts), finns även en detektor som jobbar i UV-området

Q: Vad finns det ett samband mellan vid turbidimetri?
A: Det finns ett samband mellan våglängd och partikelstorlek så olika partikar reflekterar/sprider ljus olika effektivt

Q: Vad är skillnaden mellan nefelometri och turbidimetri?
A: - Skillnaden mellan detta och turbi är var man placerar detektorn
- Detektor rakt fram - tubid
- Detektor i vinkel till strålgången - nefelometri

Q: Vad anv nefelometri till?
A: Nefelometri är känsligare för att mäta en liten mängd ljusspridning - känsligare detektion från 0-1 istället för 0-100 (turb)

Q: Hur beräknas Abs-enheter (absorbans)?
A: Absorbans - def: minus log av transmittansen (10-log)

Q: Hur kan man beskriva hur mycket ljus som förloras i kuvetten?
A: Man kan beskriva hur mycket ljus som förloras i kuvetten antingen i procent för hur mycket som stoppas, eller transmittans (det omvända)
- Om vi bara skriver transmittans tänker vi kvoten mellan ljus som går igenom vs hur mycket som skickades in

Q: Vad menas med transmittans?
A: Om vi bara skriver transmittans tänker vi kvoten mellan ljus som går igenom vs hur mycket som skickades in

Q: Vad får vi om vi anv formeln för transmittans?
A: Om vi anv formeln för transmittansen får vi absorbansenheten
- 1 betyder 0.1 - så stor andel av ljuset har passerat provet
- Spektrofotometrar kan ej mäta mer än mellan 3-4, om man är mellan 5-6 är det svart och det finns inget att mäta på, att mäta absorbans 5-10 går inte ..

Q: Vad ska abs inte blandas ihop med?
A: Enheterna Abs och Abs/cm blandas ofta ihop, men ska ej göra det!

Q: Varför jobbar man med absorbansenheter?
A: Man jobbar med absorbansenheter för att det blir ett fint samband mellan absorbansen och ffa provets koncentration

Q: Vad är Abs/cm?
A: Abs/cm - egenskapen hos en lösning, ex en vätska kan absorbera 1 abs enhet/cm

Q: Vad mäter man för avseende våglängd för absorption/transmittans?
A: Man mäter för en våglängd lämplig för den analys man vill genomföra

Q: Hur funkar denna maskin vid fotometri/turbidimetri?
A: 1. Ringen som snurrar är en kuvettring (innehåller 400 kuvetter)
2. Börjar med att prov  läggs ner prov i en tom kuvett
3. Sedan snurrar kuvetten till armarna som lägger i reagens
4. Sedan finns det en blandare med UL, som skakar provet
5. Snurrar vidare till ett område där lampa och detektor finns
6. När mätningen är klar går den till tvättstationer som suger upp och torkar ut kuvetten
- Reagenset hämtas i hål på locken
- Under hålet finns det en karusell med kasetter med reagens, så den hämta olika saker varje gång
- Kuvetter är i ett vattenbad så de hålls i rätt temp
- Den snurrar flera varv i en tidscykel, ej bara 1 varv
- Om mönstret i tryckförändringen är skumt reagerar den och säger misslyckat prov

Q: Vilken analysprincip anv för kreatinin?
A: Kopplad enzymatisk och fotometrisk

Q: Vad är enzymatisk omsättning av kreatinin kopplat till?
A: Enzymatisk omsättning av kreatinin är kopplat via 4 steg till produktion av ett rött färgämne

Q: Vad är konc av prod färgämne av kreatinin proportionellt mot?
A: Koncentrationer av producerat färgämne står i proportion till koncentrationen av kreatinin i provet

Q: Hur mäts konc av prod färgämne av kreatinin?
A: Mäts med fotometri som absorbansen vid våglängden 546 nm, bakgrund mäts vid 700 nm

Q: Hur fungerar Kopplad
enzymatisk och fotometrisk analys för kreatinin?
A: - Kopplad för vi har en reaktionsväg i flera steg med olika enzymer som är med i varje steg
- I första steget har vi enz kreatininas, specfikt för kreatinin, det sätter igång en kejda där kreatinin -> kreatin sedan kommer kreatinas och sedan kommer urea och sarosin vidare -> sakrosin oxidas -> vääteperoxid som reagerar med färgreagenser med peroxidas och då bildas ett rött färgämne

Q: Vad har de gjort vid kopplad enzymatisk och fotometrisk analys för kreatinin?
A: De har kopplat ihop ett spec biologiskt steg med något vi lätt kan mäta, vanligt att anv samma slutsteg för flera analyser

Q: Vad måste finnas vid kopplad enzymatisk och fotometrisk analys för kreatinin?
A: För att detta ska ske måste andra substrat finnas i överflöd, det enda som ska vara begränsande är kreatinin-konc

Q: Vad ska man i första hand tänka på när man ska skapa en analysmetod?
A: - När man ska sätta upp en metod att analysera något kan man i första läget fundera på om naturen kan ge oss nåra verktyg för naturen är mycket för specificitet
- Ex. Om vi vill detektera ett stort protein erbjuder naturen stora epitoper för antikroppar för specificitet

Q: Vad sker här?
A: Reaktionsspår: Kreatinin -> ändpunktsanalys

Q: Hur fås denna?
A: - När kuvettringen åker runt mäts den varje gång den passerar detektorn
- Först tillsätts provlösningen innan man börjar mäta, sedan tillsätts reagens (R1, R2 eller R3)
- Då får vi en lång rad med mätningar, men vi anv bara mätpunkt 22 och 38 för att mäta konc av kreatinin, andra är onödiga, men instrumentet kan anv andra mätpunkter för att utvärdera om det var en bra eller dålig mätning (utvärdering av metoden)
- I slutet av reaktionen där vi tar en sista mätpunkt har analysen gått mot en platå och vi mäter något i slutet

Q: Vad sker med absorbansen genom grafen?
A: - Absorbansen ökar ju längre tiden går och ju mer kreatinin vi har i blodet
- Reaktionsrikning: Ökning av abs

Vad ses här?

Q: Vilken typ av analys är detta och vilken reaktionsriktning är det?
A: - Detta är en rate-analys, ej en end-point analys
- Istället för att anv skillnadne mellan 2 punkter anv vi lutningen här
- Minskade reaktionsriktning
- Ju mer urea desto brantare kommer lutningen vara
- Ibland kan det vara bra att gå in och kolla på reaktionsspåret för att se vad som hänt i kuvetten

Q: Hur kan man analysera Magnesium?
A: Kolorimetriskt komplex

Hur analyseras Mg2+ med olorimetriskt komplex?

Q: Vad sker vid kolometriskt komplex?
A: - Vi häller på ett färgagens som bildar ett komplex som vi kan mäta
- Hur starkt en färgförändring blir beror på hur mycket komplex som bildas och hur mycket mg som finns i blodet

Hur analyseras cystatin C?

Hur går immunturbidimetri till?

Q: Vad baseras immunturbidimetri på?
A: Baseras på att större partiklar sprider mer ljus än små partiklar, vad som är en stor resp liten partikel baseras på våglängden

Q: Hur går immunturbidimetri till, kort?
A: - Om man blandar analyten med antikroppsmärkta latexpartiklar bildas det komplex
- Behöver ej binda till partiklar, om antigen bildar epitoper kan man klara sig utan latexpartiklarna
- Det finns partikleförstärkt, men även utan

Q: Hur kan man konc bestämma ett enzym?
A: Ibland vill vi konc-bestämma ett enzym - man gör en enzym-analys och man tilsätter ett substrat som startar en kedja

Q: Vad är HIL-indexmätning?
A: Kontroll för 3 vanliga orsaker till interferens

Hur kan hemolys, ikterus och lipemi påverka prov?

Vad ger en separat mätning av HIL-index?

Q: Varför gör man en HIL-indexmätning?
A: - Man gör ofta också denna extramätning, som anv för att upptäcka valiga källor till interferenser, mätfel
- Om det är över tröskelvärde för varje analys säger det att resultatet inte är pålitligt och det förkastas,
- Detta är en separat mätning som tilläggsbeställs

Hur utförs elektrokemoluminiscens (ECL, ECLIA)?

Q: Hur sker reaktionen vid elektrokemoleminiscens?
A: - Man mäter elektrokemoluminiscens
- Det som ger ljusreaktionen är att man har rutenium bundet nära en elektrod, när eletroden slås på stjäl den elektroner från rutenium så den oxideras
- I nästa steg kommer TPA göra att rutenium reduceras tillbaka och i samband med detta skickas det ut ljus, det ljuset mäts
- För att detta ska ske måste rutenium befinna sig nära elektroden

Q: Vad kan sägas om känsligheten hos elektrokemiluminiscens?
A: Detta ä den känsligaste metoden att detektera låga nivåer av elektrolyt

Q: Hur fungerar denna?
A: - När man slår på magneten fastnar järnatomerna där och vi kan tvätta bort annat smuts som kan störa
- Arbetselektroden slås på och pärlorna fastar och när detta sker skickas det ut ljus som kan detekteras

Q: Vad är pärlorna märkta med vid ECL?
A: - De magnetiska pärlorna är täckta med ngon som binder starkt till biotin

Q: Vilka typer av ECL finns?
A: - Sandwich och kompetitiv

Q: Hur varierar sandwich beroende på om det finns analyt eller ej?
A: - Om vi ej har analyt etableras ingen sandwich (lager), analyten bildar ingen brygga som håller kvar rutenium i cellen, ingen signal
- Om analyt finns binds rutenium till pärlan den stannar kvar och vi får en signal

Q: Hur varierar kompetitiv ECL beroende på om det finns analyt eller ej?
A: - På pärlan har vi antigen som är biotinmärkta, som är del av reagenset, och om vi ej har analyt i provet bildas komplex mellan reagensmolekylerna
- Om vi tillsätter ett prov med hög konc av analyt kommer Ak binda antigen i provet istället och rutenium tvättas bort från elektrodytan

Q: Hur sker signalskillnaderna ut mellan sandwich och kompetitiv beroende på hur mycket analyt som tillsätts?
A: - Mer signal ju mer analyt - sandwich
- Mindre signal ju mer analyt - kompetitiv

Q: När anv kompetitiv ECL?
A: Kompetitiv anv för små molekyler man vill detektera

Q: När görs en kalibrering?
A: Grundläggande för att
mäta något och få ett reusltat

Q: Hur görs en kalibrering?
A: - Man tar 2 kalibratorer som har en änd-konc och mäter och ser vilken signal de får och från det kan vi skapa en kalibreringskruva
- För att detta ska bli korrekt måste vi veta konc i kalibratorn med stor säkerhet, kalibratorn måste ha en spårbarhet

Q: Vad mer kan man ha en spårbarhet till vid kalibrering?
A: Man kan också ha en spårbarhet till ett referensmaterial, referensprov, som säljs till alla labb och vi har då en spårbarhet till ett referensprov och ej ett referensmaterial

Q: Hur kan denna kalibrerinsgkurva förklaras?
A: - Det område där kurvan är linjär har vi ett mätintervall, mätanalysen funkar bra i det intervallet, om vi går för högt slår vi ett tak i detektorn
- Referensintervallet har också ett nedre intervall av statistiska orsaker

Vad tänker man på vid val av analysmetod?

Vad ska man tänka på när man utvecklar en analysmetod?

Q: Vilken typ av ECL anv för vad?
A: - Kompetitiv är för mindre saker
- Sandwich är för större proteiner och molekyler