Title: LÄK BasV2_M1–3 / Molekylär biologi

Q: Cellcykelns olika faser
A: —> många kroppsceller i G0 (do not experience the presence of a mitogen)

Q: Checkpoints i cellcykeln
A: 1. Restriction point (Start!)
2. G2 Checkpoint (if NO —> Stop & Repair)
3. Mitotic Checkpoint

Q: Hur varierar Cdk-aktiviteten under cellcykeln?
A: Cdk-aktivitet driver cellcykeln:
Aktiviteten beror på Cdk-typen:

Q: Hur är Cdk uppbyggt? Hur påverkar denna uppbyggnad dess aktivitet?
A: Kinas. Protein som ändrar andra proteiners aktivitet genom att sätta på fosfatgrupper (fosforylering) – aktivering oftast.
—> Cdk MÅSTE bindas till en cyklin för att bli aktivt.
—> Aktivt Cdk ändrar tusentals proteiner i en cell.
—> Väsentliga för att driva cellcykeln framåt.

Q: Hur kan Cdk:er driva cellcykeln framåt?
A: Feedback-mekanismer —> unidirektionell cellcykel.

Q: M-fasen delas in i [...] och [...].
A: mitos; cytokines

Mitosens olika faser är (successivt) profas, prometafas, metafas, anafas, telofas. Cytokines följer mitosen.

Q: Profas
A: Cdk-aktivitet säkerställer att:
- Mikrotubuli är organiserade från två poler (centrioler)
- DNA-kompaktering blivit initierad (cf. bild).

Q: Prometafas
A: Cdk-aktivitet säkerställer att:
- Kärnmembranet (nukleärmembranet) är nerbrutet
- Mikrotubuli fäster vid centromeren på kromosomen
(Mikrotubuli behöver fästa så att kromosomerna blir dragna på ett korrekt sätt. Finns en spänning (tension) som skickar en signal om att kromosomerna fäst vid motsatta poler = checkar att vi fäst till sisterkromatider).

Q: Metafas
A: Cdk-aktivitet säkerställer att:
1. Kromosomerna trycks och dras mot cellcentern tack vare mikrotubuli.
2. När alla kromosomer fäst vid mikrotubuli från två håll: M-fas-cykliner degraderas.

Q: Anafas
A: Frånvaro av Cdk-aktivitet utlöser (triggers):
- Degradering av proteinkomplexet (kohesin) som håller sisterkromatiderna samman
- Kromosomdragning mot de två polerna.

Q: Telofas
A: Frånvaro av Cdk-aktivitet säkerställer att:
- Kromosomerna når polerna
- Kontraktionsproteiner (aktin+myosin) smalnar av (narrows) cellen vid mitten (cleavage furrow —> start of cytokinesis).

Q: Cytokines
A: Frånvaro av Cdk-aktivitet säkerställer att:
- En kontraktil proteinring (cleavage furrow) delar isär cellen.
—> Resultat: Två dotterceller med identiskt genetiskt material som modercellen.

Q: Semikonservativ replikation
A: 1 ny + 1 parent sträng = semikonservativ:

Q: Diskontinuerlig replikation (låååångt)
A: - DNA-polymeras kan bara lägga till nukleotider vid 3'-änden av den sista nukleotiden i kedjan.
- Det kan därför bara syntetisera en ny DNA-sträng i 5'–>3'-riktning (3'–>5'-riktning för template strand).
- Leading strand kan enkelt syntetiseras kontinuerligt då den löper i 5'–>3'-riktning.
- Däremot är det inte så lätt för lagging strand, då den löper i 3'–>5'-riktning. DNA-polymeraset kan då inte lägga till nya nukleotider vid 5'-änden i replikationsgaffeln.
- Detta löses tack vare att nya nukleotider läggs till vid 3'-änden baklänges (således i 5'–>3'-riktning). Det görs i flera steg, fragmenter, som kallas för Okazakifragmenter.
- RNA-primers syntetiseras av DNA-primas för att främja DNA-polymeraset vid varje fragment. De gamla RNA-primers som skapades av tidigare fragmenter tas bort (av RNAse) och ersätts sedan med DNA.
- Slutligen binds fragmenterna ihop m h a DNA-ligas.

Q: Dubbelriktad replikation
A: (=Bidirectional). Går åt två håll samtidigt.

Q: Vad finns det för skillnader i replikation mellan den ledande och den sackande (lagging) strängen?
A: - DNA-polymeras kan bara lägga till nukleotider vid 3'-änden av den sista nukleotiden i kedjan.
- Det kan därför bara syntetisera en ny DNA-sträng i 5'–>3'-riktning (3'–>5'-riktning för template strand).
- Leading strand kan enkelt syntetiseras kontinuerligt då den löper i 5'–>3'-riktning.
- Däremot är det inte så lätt för lagging strand, då den löper i 3'–>5'-riktning. DNA-polymeraset kan då inte lägga till nya nukleotider vid 5'-änden i replikationsgaffeln.
- Detta löses tack vare att nya nukleotider läggs till vid 3'-änden baklänges (således i 5'–>3'-riktning). Det görs i flera steg, fragmenter, som kallas för Okazakifragmenter.
- RNA-primers syntetiseras av DNA-primas för att främja DNA-polymeraset vid varje fragment. De gamla RNA-primers som skapades av tidigare fragmenter tas bort (av RNAse) och ersätts sedan med DNA.
- Slutligen binds fragmenterna ihop m h a DNA-ligas.

Q: Replikationsgaffel och hur den uppstår
A: Två replikationsgafflar som uppstår per replikationsstartpunkt (replikationsorigin) tack vare helikas; replikationsbubbla skapas.

Q: RNA-primer och hur den skapas
A: - De nya nukleotiderna måste läggas till någonting —> RNA-primern.
- Skapas av DNA-primas («primes» the reaction):
- Många RNA-primers i sackande (lagging) strängen —> för att skapa Okazakifragmenter:
(här: ingen trifosfat för att binda samman fragmenterna —> DNA-ligas kommer behövas)

Q: DNA-polymeras, funktion i replikationsprocessen.
A: Katalyserar DNA-replikering efter det att parental-DNA:t öppnats av DNA-helikas, replikationsgaffel skapas. Replikation stoppas när två replikationsgafflar möts.
- DNA polymeras har även en proofreading mekanism, vilket innebär att den går tillbaka ett steg i 3’–>5’ riktning och ser till att nukleotiden på den nya DNA-kedjan är komplementär med parental strängen (3'–>5' exonuclease activity):

Q: DNA-polymeras har två funktioner: (1) [...] och (2) [...].
A: 5'–>3' DNA-polymeras; 3'–>5' exonukleas
Back Extra: —> Cleaves in the OTHER direction («whoops let's go back and fix this»).
Each replication round: still 1 mutation/10^9nt.

Q: Helikas, funktion i replikationsprocessen.
A: Helikas öppnar kedjan och det bildas då två replikationsgafflar och detta skapar en replikationsbubbla som sprider sig längs DNA:t. Möjliggör bindning av ytterligare transkriptionsfaktorer samt DNA-primas och DNA-polymeras.

Q: [...] har för uppgift att skapa [...] under replikationsprocessen.
A: DNA-primas; en RNA-primer

Q: Vad är problematiken med att replikera telomererna (kromosomändarna)?
A: Den sackande strängen kan inte bli fullt replikerad eftersom det inte finns någon sekvens som kan användas för att skapa RNA-primern, efter att den sista tagits bort (cf. Okazakifragmenter).
Lösning: Enzymet telomeras som elongerar den sackande strängen genom att skapa DNA m h a en bit RNA inbyggd in i enzymet. En sekvens för primern att binda till skapas således.
MEN många celler saknar telomeras —> blir kortare för varje celldelning —> kan bara dela sig ~100ggr, sedan couic (=replicative senescence) – förebygger tumörutveckling
—> för vissa celler :D, för andra ;(
—> T ex: (1) stamceller+könsceller, viktigt att telomeras finns där så att de kan dela sig mer; (2) cancerceller, kan aktivera om telomeras och dela sig en massa gånger.

Front: Nämn flera mekanismer som leder till olika typer av förändringar (mutationer) i DNA.
Back: - Depurinering: Purinbaser förloras (A/G) spontant. DNA-backbone brister inte men tar bara bort en purinbas.
- Deaminering: En amingrupp förloras spontant från en cytosin i DNA:t för att produceras basen uracil.
- UV-strålning: Främjar kovalent bindning mellan två intillsittande pyrimidinbaser —> formar t ex tymindimerer (då kan inte replikeringsmaskineri fungera som den ska).
- Finns andra som kan förorsakas av reaktiva kemikalier (del av kroppens metabolism eller externa).
- Felaktiga baser kan också tillsättas under replikationen.
—> Alla kan leda till mutationer (när en felaktig DNA-sträng replikeras) om kroppen inte lyckas laga dessa modifikationer eller om den råkar laga fel (chansen ökar ju fler mutationer det finns).
Fusk: 5st

Front: Det finns flera olika reparationssystem för att reparera DNA-skador. Vilka?
Back: - Base Excision Repair (p g a mutagener —> bara en bas, först utan backbone, sedan bye bye backbone lokalt).
- Nucleotide Excision Repair (p g a mutagener —> med backbone).
- Mismatch Excision Repair (p g a fel under replikationen).
- Reparation av dubbelsträngade brott: (1) homologt och (2) icke-homologt.
Fusk: 4st

Q: Base Excision Repair
A: «Remove-fill in-seal» type of repair, liknar sackande strand-replikering.
1. Ta bort felet. Glykosylas tar bort den felaktiga basen (+endonukleas klipper 5'-änden mellan fosfatresten och följande nukleotid & samma vid 3'-änden: endonukleas alt. fosfodiesteras).
2. Fylla in med basparning. Polymeras.
3. Försluta strängen. DNA-ligas.

Q: Nucleotide Excision Repair
A: «Remove-fill in-seal» type of repair, liknar sackande strand-replikering. Används för att laga t ex tymindimerer.
1. Ta bort felet. Nukleas+endonukleas tar bort den(/de) felaktiga nukleotiden(/er).
2. Fylla in med basparning. Polymeras.
3. Försluta strängen. DNA-ligas.

Q: Mismatch Excision Repair
A: Korrigerar felaktiga baser som satts på under replikering.
Tar bort en hel bit av DNA (transkriptionsfaktorer+helikas+exonukleas–frigjord 5'-ände tack vare helikas=exo) & omsyntetiserar (DNA polymeras).
Parental strand ser annorlunda ut utifrån dess backbone därför är det enklare att veta var felet sitter.

Q: Reparation av dubbelsträngade brott
A: När båda DNA-strängarna är brutna, p g a single strand breaks eller gammastrålningsirradiering.
Kan antingen vara homologt eller icke-homologt:
- (Homologt) rekombination – behöver en icke-skadad sisterkromatid som då kopieras —> perfekt lagning (behöver alltså en kopia=template)
- (Icke-homologt) end joining – de två brutna ändena limmas tillsammans —> vissa nukleotider förloras (mindre precist, men bättre än ingenting)

Q: BRCA-mutationer
A: BRCA-proteinet ansvarar för en typ av reparation som sker genom rekombination där man behöver en helt oskadad systerkromatid som används som facit/template. Sker det mutationer på BRCA-genen blir det högre risk för bröstcancer som även är en ärftlig sjukdom (multifaktoriellt).

Q: Vad är betydelsen av apoptos?
A: Under utvecklingen:
- Fingrar och tår, förebygger sammanvävda händer och fötter
- Tar av nervceller.
Under livet:
- Behåller balansen i immunsystemet
- Tar av skadade celler, t ex celler som fastnat i DNA-skadeinducerat cellcykelstopp.

Q: Hur kan apoptos aktiveras?
A: - Intracellulär aktivering: (1) DNA-skada som upptäcks under cellcykeln, eller (2) Skadade organeller
- Extracellulär aktivering: S k dödreceptorer på cellytan aktiveras av extracellulära signalmolekyler (t ex under utvecklingen).

Q: Hur kan apoptos motverkas?
A: - Mitogener – stimulerar celldelning (startar cellcykeln)
- Tillväxtfaktorer – stimulerar celltillväxt
- Överlevnadsfaktorer – inhiberar apoptos.

Q: Vilken roll har kaspaser i apoptosen?
A: Kaspaser är en typ av proteaser som aktiveras under apoptosen och klyver sönder olika substrat i cellen (t ex kärnmembran).
—> Aktiveringssignalen amplifieras = en kaspas aktiverar andra:

Q: Vad är skillnaden mellan nekros och apoptos?
A: - Under apoptosen —> PROGRAMMERAD CELLDÖD:
1. cellen skrynklar ihop («raisin») – utan att brista, – cytoskelettet samt kärnmembranet kollapsar och kromosomerna fragmenteras.
2. Den döende cellen presenterar signaler på ytan som attraherar makrofager —> kommer «äta upp» den döende cellen.
3. Ingen läckage av cellinnehåll till vävnaderna, ingen inflammation.
- Nekros uppstår när vävnader skadas, cellen brister. Cellinnehåll läcker in i vävnaden, vilket förorsakar inflammation. Under apoptos uppstår det ingen läckage av cellinnehåll till vävnaderna, ingen inflammation —> OREGULERAT DÖENDE.

Q: Vad består en kromosom av?
A: Kromatin —> DNA som lindats in runt histoner, lagras i sin tur i nukleosomer (8st histoner) som packas till kromosomer.
Består av:
- Telomerer
- Centromer
- Replikationsstart/Replikationsorigin
—> kromosomerna är bara väldigt hårt packade under mitosen och då kan man se dem.
—> Finns hetero- (hårt packat) samt eukromatin (löst packat, enklare att transkribera).

Q: Heterokromatin
A: Hårt packat DNA.
Svårare att transkribera.

Q: Eukromatin
A: Löst packat DNA.
Enklare att transkribera.

Q: Hur sitter histonerna ihop med DNA?
A: Finns 8st histoner (4 typer, två av varje) som bildar en histonoktamer —> histonoktamer + DNA (två loopar) = nukleosom.
+H1 som står på ingångs- och utgångssäten av DNA —> DNA blir mer stabilt associerad med histonerna —> ännu mer packat, hjälper med att packa nukleosomerna tillsammans (på kromatinfibern).
2 H2A, 2 H2B, 2 H3, 2 H4.

Q: Vad har histoner och DNA för egenskaper som gör att de sitter bra ihop?
A: DNA är negativt laddat p g a fosfatgrupper medan histonerna är positivt laddade p g a Arg+Lys som finns i aminosyrasekvensen.
—> Stark interaktion.

Q: I vilken form är kromatinet i telomerer och centromerer?
A: Heterokromatin.

Q: Kromatinloopar
A: Ytterligare en packningsnivå på kromatinet.
Kromatinfibrerna kommer skapa loopar som «fångas» av SMC-proteiner (SMC-proteinerna är helt nödvändiga här).

Q: Vad finns det för olika typer av histonmodifieringar?
A: Det är histonänderna (histone tails) som kan modifieras —> EPIGENETISKA KODEN.
- Metylering, M: Interagerar starkt med andra histoner –>heterokromatin
- Acetylering, Ac: Nukleosomerna repulserar varandra (repulsiva laddningar: DNA=–; Ac=–) –>genuttryck
- Fosforylering, P: –>genuttryck (cf. Ac)
Finns olika möjliga kombinationer:

Q: Hur kan histonmodifieringar spridas?
A: Histonmodifieringar i egenskap av heterokromatinfrämjande histonmodifieringar kan spridas tack vare att de attraherar heterokromatinspecifika proteiner som kommer då modifierar närliggande histoner.
Detta sker tills att en barriär-DNA-sekvens nås.

Q: DNA-metylering
A: Tillsats av en metylgrupp i CG-rika öar —> blockerar transkription.
Om metyleringen sker i promoterområden = «du kan inte starta transkriptionen här» —> gene silencing!

Q: Hur ser nedärvningsmönstret ut för epigenetiska modifieringar?
A: Epigenetiska modifieringar (histonmodifieringar & DNA-metylering) kan nedärvas, t ex:
(Om det sker i gameterna).

Q: Genreglerande mekanismer
A: —> Olika typer av transkriptionell kontroll
- Regulatoriska DNA-sekvenser —> aktivator & repressor som binder till specifika genreglerande DNA-sekvenser = 2 olika vägar att reglera DNA på, i många fall samspelar de —> handlar om balans:
- Promotors och enhancers (stimulerar transkription, binder till en massa transkriptionsfaktorer) = genreglerande sekvenser – kromatinloopar kan finnas här och göra så att enhancersekvenserna sitter långt ifrån promotern/genstarten:
- Kromatinregulering – t ex histonacetylering så att nukleosomerna repellerar varandra—>DNA=mindre kompakt—>eukromatin:

Q: Introner VS exoner
A: En gen är ett kodande lokus på DNA-strängen. Kodar för ett speciellt protein eller RNA. Eukaryota gener består av promotorer, exoner (kodande delar av gener–>genuttryck, kan även tas bort vid alternativ splitsning) och introner (icke-kodande, klipps bort).

Q: Hur fungerar en promoter?
A: Regulatorisk sekvens som indikerar var transkripten ska börja. TATA-boxen är en sekvens som återfinns i de flesta promoters.

Q: Transkriptionsfaktorer
A: Proteiner som krävs för transkription (RNA-polymeras är inte det enda nödvändiga proteinet!).
—> T ex TBP (TATA-binding protein) som (1) känner igen DNA-sekvenser (TATA-boxen) och (2) binder och böjer DNA:t —> kan rekrytera andra transkriptionsfaktorer, bl a en helikas, och sedan RNA-polymeras.

Q: Transkriptionsprocessen: initiering
A: TBP (TATA-binding protein) som (1) känner igen DNA-sekvenser (TATA-boxen) och (2) binder och böjer DNA:t —> kan rekrytera andra transkriptionsfaktorer, bl a en helikas, och sedan RNA-polymeras.

Q: Transkriptionsprocessen: elongering
A: Mer åt 60 [nt/s]-hållet —> snabbt, men misstag kan ske oftare än med DNA-polymeras —> mindra viktigt här då RNA:t inte ska överföras till dotterceller.

Q: Transkriptionsprocessen: terminering
A: Terminator/terminering-DNA-sekvens som indikerar var transkripten ska stoppa —> DNA-sekvensen bestämmer var transkriptionen stoppas.
(+klyvningsfaktorer som klyver loss det nysyntetiserade mRNA:t från RNA-polymeraset)

Q: Vad finns det för olika RNA-polymeraser och vad är deras respektive funktion?
A: MEN bara 1 RNA-polymeras hos bakterier!

Q: RNA processeras i [...].
A: cellkärnan

Q: Hur processeras mRNA i cellkärnan?
A: - mRNA-capping: Tillsats av en modifierad guaninnukleotid (G) vid RNA:ts 5'-ände
- pre-mRNA-splitsning: Borttagning av introner
- mRNA-polyadenilering: Tillsats av 150-200 adeninnukleotider (A).

Q: 5'-capping
A: Typ av mRNA-modifiering: Tillsats av en modifierad guaninnukleotid (G) vid RNA:ts 5'-ände.

Q: pre-mRNA-splitsning
A: Typ av mRNA-modifiering. Mål=ta bort introner + binda samman exoner.

Q: Splitsning och alternativ splitsning
A: - Transkripter kan splitsas på olika sätt (=alternativ splitsning) —> ökar kodningspotentialen = många fler möjliga proteiner
- Sker i spliceosomer (med snRPS), som består av snRNAs (small nuclear ribonucleic acid) i komplex med proteiner, detta bildar snRNPs.
- snRNPs i spliceosomens kärna binder till pre-mRNA:t och binder intronerna till sig själva i en lariatstruktur och klipper sedan bort dem samt sätter ihop exoner
- 95% av transkripter har alternativ splitsning
- ~~30'000 gener (~20'000≈de som bara kodar för funktionella proteiner, där RNA inte är slutprodukten) MEN många fler proteiner!

Q: 3'-polyadenylering
A: Typ av mRNA-modifiering.
1. mRNA:t klyvs loss från RNA-polymeraset tack vare klyvningsfaktorer
2. PAP (poly-A-polymeras) lägger till adenin (A), inget template krävs —> Poly-A-svans (Poly-A-tail): 150-200nt.
—> Stabiliserar 3'-änden.

Q: Hur kvalitetskontrolleras processerade mRNA-molekyler före transport till cytoplasman?
A: mRNA-cap samt -poly-A-svans markerar RNA som «mRNA» —> andra proteiner kan binda på cap & svans —> de regulerar export OCH translation
—> RNA blir exporterat som ett RNA-protein-komplex
—> «Dålig» RNA blir degraderat av exosomer

Q: Vad är betydelsen av alternativ splitsning för organismens funktion och evolutionär utveckling?
A: - När exonerna binds samman kan exoner exkluderas (men deras ordning kan ej kastas om). Detta kallas alternativ splitsning och resulterar i att en gen kan koda för ett flertal proteiner. 95% av generna har alternativ splitsning.
- Ger ett mer kompakt genom och större möjlighet till genetisk variation.
- Nya proteiner evolverar genom att «mixa» exoner från existerande proteiner.
- —>Genom evolution kan ett av de proteiner som en gen genererar och som fungerar bättre selekteras. Nya och nödvändiga protein uppkommer även enklare eftersom koden för dem redan finns i genomet.

Q: Nukleolen
A: rRNA produceras i nukleolen, ribosomala gener finns där (=specifik region in i kärnan, svartare p g a (icke-funktionella) ribosomstrukturer).

Q: [...] av all RNA är [...].
A: 80%; rRNA

Q: Hur processeras rRNA?
A: De flesta rRNA skapas av RNA pol I —> ingen 5'-cap eller poly-A-svans.
1. 200nt blir kemiskt modifierade
2. Prekursor-rRNA blir kluvet:
En ribosom består av en stor och en liten subenhet. Det processade rRNA:t används för att skapa de två enheterna tillsammans med ribosomproteiner som ansluter från cytoplasman. Stora=60S, lilla=40S och de båda enheterna bundna tillsammans =80S.

Q: Hur processeras tRNA?
A: 1. Intronerna (blå) splitsas av
2. 5'-änden (grön) klyvs
3. UU-rester vid 3'-änden bytts ut med en CCA-sekvens (röd)
4. Flera olika baser modifieras (gula)
—> tRNA processeras i kärnan och exporteras sedan till cytoplasman i komplex med accessoriska proteiner.